產(chǎn)品概述：
本試劑盒采用改進(jìn)的SDS 堿裂解法，結(jié)合DNA制備膜選擇性地吸附DNA的方法達(dá)到快速純化質(zhì)粒DNA的目的。適合于從120-300 ml （OD600 為1-1.5）細(xì)菌培養(yǎng)物中提取多至600 μg高純的質(zhì)粒DNA，用于測序、體外轉(zhuǎn)錄與翻譯、限制性內(nèi)切酶消化、細(xì)菌轉(zhuǎn)化等分子生物學(xué)實(shí)驗。
一、試劑盒組成、貯存、穩(wěn)定性
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Cat.No. |
UE-MX-P-10 |
UE-MX-P-25 |
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Kit size |
10 preps |
25 preps |
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Maxiprep column |
10 |
25 |
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RNase A |
270 μl |
700 μl |
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Buffer S1 |
115 ml |
285 ml |
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Buffer S2 |
115 ml |
285 ml |
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Buffer S3K |
115 ml |
285 ml |
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Buffer B |
115 ml |
285 ml |
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Buffer W1 |
2×80 ml |
350 ml |
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Buffer W2 concentrate |
2×36 ml |
150 ml |
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Eluent |
25 ml |
60 ml |
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Protocol manual |
1 |
1 |
RNase A ：50 mg/ml, 室溫貯存6個月；長期貯存于-20℃。
Buffer S1：細(xì)菌懸浮液，加入RNase A后，混合均勻，4℃貯存。
Buffer S2：細(xì)菌裂解液（含SDS/NaOH），室溫密閉貯存。
Buffer S3K：中和液，室溫密閉貯存。
Buffer B：DNA結(jié)合溶液，室溫密閉貯存。
Buffer W1：洗滌液，室溫密閉貯存。
Buffer W2 concentrate：去鹽液。使用前，按試劑瓶上指定的體積加入無水乙醇（用100%乙醇或95%乙醇），混合均勻，室溫密閉貯存。
Eluent：2.5 mM Tris-HCI，pH 8.5，室溫密閉貯存。
二、注意事項
1. 細(xì)菌過量將影響溶菌及質(zhì)粒DNA的釋放。
2. 在步驟3和步驟4中操作必須溫和。劇烈搖晃，將導(dǎo)致基因組DNA的污染。但混合必須充分，否則影響得率。
3. 在加入Buffer S3K時，蛋白質(zhì)和基因組DNA形成粘稠的白色絮狀沉淀，必須充分混合均勻，使凝集塊中間也得到充分中和凝結(jié)。
4. DNA 分子呈酸性，建議在2.5 mM Tris-HCI，pH 8.5洗脫液中保存。
常見問題解答：
◆同樣體積的新鮮菌液，為什么有些提取的質(zhì)粒濃度高，而有些質(zhì)粒的濃度低？這些情況應(yīng)該如何處理？
質(zhì)粒提取高低的一個重要決定性因素是質(zhì)粒載體的拷貝數(shù)，即質(zhì)粒在一個大腸桿菌中的數(shù)目。對于低拷貝數(shù)的質(zhì)粒，需要適當(dāng)增加菌液的收集量，詳情請參閱說明書。
以下是幾種常見載體的拷貝數(shù)：
粒提取1.png.png)
◆使用UE質(zhì)粒大量制備試劑盒時，在DNA結(jié)合/洗滌步驟中能否使用離心法？
可以，使用與離心機(jī)配套的離心管可以進(jìn)行離心。
◆我提取的質(zhì)粒為什么會有基因組條帶？
菌體在裂解和中和過程中如果操作過于劇烈就容易引起基因組污染。加入Buffer S2后要輕柔混勻，加入Buffer S3后混合均勻。如果發(fā)現(xiàn)裂解物在操作過程中過于黏稠，需要適當(dāng)降低菌體的用量。
◆我提取的質(zhì)粒在電泳圖片上看，有一條緊挨著主帶的小條帶請問這是什么原因？如何判定它是否是雜帶？
那條帶很有可能就是變性條帶。如果在加入Buffer S2后沒有及時混勻菌體，會導(dǎo)致菌體局部堿性過強(qiáng)，破壞質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)，在加入Buffer S3后質(zhì)粒無法完全復(fù)性，就產(chǎn)生了這樣的變性條帶。
檢測的方式是通過酶切檢測，如果這條帶在酶切后依然存在，則是變性條帶，如果酶切后消失，則可能是質(zhì)粒的不同狀態(tài)。
◆我提取的質(zhì)粒有明顯的RNA污染，請問是什么原因？
可能有以下兩種可能：
1、RNase A活力下降。Buffer S1在加入RNase A后要保存在4℃冰箱。如果室溫放置，RNase A活力會下降，導(dǎo)致RNA污染。
2、菌體過量。如果使用的菌體量過多，也可能導(dǎo)致RNA污染。適當(dāng)減少菌體的用量。
◆質(zhì)粒得率很低，請問是什么原因？
質(zhì)粒低的可能因素很多，以下是幾種可能原因：
1、菌體過量，導(dǎo)致菌體不能完全裂解和中和，最終導(dǎo)致質(zhì)粒得率低。
2、Buffer W2中未按瓶子上得標(biāo)注體積加入乙醇。
3、菌體老化，影響提取的效果。建議對菌液進(jìn)行劃板培養(yǎng)，篩選新鮮克隆。◆請問Eluent Buffer的配方是什么？對于DNA測序有沒有影響？
Eluent Buffer 的配方是2.5mM Tris-HCl,pH8.0。質(zhì)粒在這樣的溶液中能夠穩(wěn)定保存，而且測序不受影響。
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