產(chǎn)品概述：
本試劑盒采用SDS 堿裂解法，結(jié)合DNA 制備膜選擇性吸附DNA。同時(shí)采用特殊溶液（Buffer ETR和 Buffer PF）有效去除內(nèi)毒素，可從80-200 ml （OD600 為1-1.5）細(xì)菌培養(yǎng)物中提取出多至600 μg 高純度質(zhì)粒 DNA，其內(nèi)毒素水平控制在0.1 EU/μg 以下。
一、試劑盒組成、貯存、穩(wěn)定性
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Cat.No. |
UE-MX-EP-10 |
UE-MX-EP-25 |
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Kit size |
10 preps |
25 preps |
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Maxiprep column |
10 |
25 |
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RNase A |
270 μl |
700 μl |
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Buffer S1 |
115 ml |
285 ml |
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Buffer S2 |
115 ml |
285 ml |
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Buffer S3K |
115 ml |
285 ml |
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Buffer B |
115 ml |
285 ml |
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Buffer W1 |
2×80 ml |
350 ml |
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Buffer W2 concentrate |
66 ml |
150 ml |
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ET-free water（70%Ethanol） |
7.5 ml |
18 ml |
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Eluent A |
30 ml |
70 ml |
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Buffer ETR |
50 ml |
120 ml |
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Buffer PF |
13 ml |
30 ml |
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Protocol manual |
1 |
1 |
RNase A：50 mg/ml，室溫可貯存6個(gè)月，長(zhǎng)期貯存于-20℃。
Buffer S1：細(xì)菌懸浮液。加入RNase A后，混合均勻，4℃貯存。
Buffer S2：細(xì)菌裂解液（含SDS/NaOH），室溫密閉貯存。
Buffer S3K：中和液，室溫密閉貯存。
Buffer B：DNA結(jié)合溶液，室溫密閉貯存。
Buffer W1：洗滌液，室溫密閉貯存。
Buffer W2 concentrate：去鹽液。使用前，按試劑瓶上指定的體積加入無水乙醇（可用無水乙醇或95% 乙醇）?；旌暇鶆?，室溫密閉貯存。
ET-free water（70%Ethanol）：使用前，按試劑瓶上指定的體積加入無水乙醇（可用無水乙醇或95%乙醇）?；旌暇鶆颍覝孛荛]貯存。
Eluent A：洗脫液。室溫密閉貯存。
Buffer ETR：內(nèi)毒素去除液。室溫密閉貯存。
Buffer PF：分相緩沖液。室溫密閉貯存。
二、注意事項(xiàng)
1. 細(xì)菌過量將影響細(xì)菌裂解、質(zhì)粒DNA的釋放，導(dǎo)致內(nèi)毒素含量過高。
2. 步驟3和步驟4的操作必須溫和。劇烈搖晃將導(dǎo)致基因組 DNA 的污染。但混合必須充分，否則影響得率。
3. 在加入Buffer S3K 時(shí)，蛋白質(zhì)和基因組DNA形成粘稠的白色絮狀沉淀，必須充分混合均勻，使凝集塊中間也得到充分中和凝結(jié)。
4. Buffer S2、Buffer S3K、Buffer B和 Buffer W1含刺激性化合物，操作時(shí)要戴乳膠手套和防護(hù)眼鏡，避免沾染皮膚、眼睛和衣物，謹(jǐn)防吸入口鼻。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要立即用大量清水或生鹽水沖洗，必要時(shí)尋求醫(yī)療咨詢。
常見問題解答：
◆同樣體積的新鮮菌液，為什么有些提取的質(zhì)粒濃度高，而有些質(zhì)粒的濃度低？這些情況應(yīng)該如何處理？
質(zhì)粒提取高低的一個(gè)重要決定性因素是質(zhì)粒載體的拷貝數(shù)，即質(zhì)粒在一個(gè)大腸桿菌中的數(shù)目。對(duì)于低拷貝數(shù)的質(zhì)粒，需要適當(dāng)增加菌液的收集量，詳情請(qǐng)參閱說明書。
以下是幾種常見載體的拷貝數(shù)：
粒提取1.png.png)
◆我提取的質(zhì)粒為什么會(huì)有基因組條帶？
菌體在裂解和中和過程中如果操作過于劇烈就容易引起基因組污染。加入Buffer S2后要輕柔混勻，加入Buffer S3后混合均勻。如果發(fā)現(xiàn)裂解物在操作過程中過于黏稠，需要適當(dāng)降低菌體的用量。
◆我提取的質(zhì)粒在電泳圖片上看，有一條緊挨著主帶的小條帶請(qǐng)問這是什么原因？如何判定它是否是雜帶？
那條帶很有可能就是變性條帶。如果在加入Buffer S2后沒有及時(shí)混勻菌體，會(huì)導(dǎo)致菌體局部堿性過強(qiáng)，破壞質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)，在加入Buffer S3后質(zhì)粒無法完全復(fù)性，就產(chǎn)生了這樣的變性條帶。
檢測(cè)的方式是通過酶切檢測(cè)，如果這條帶在酶切后依然存在，則是變性條帶，如果酶切后消失，則可能是質(zhì)粒的不同狀態(tài)。
◆我提取的質(zhì)粒有明顯的RNA污染，請(qǐng)問是什么原因？
可能有以下兩種可能：
1、RNase A活力下降。Buffer S1在加入RNase A后要保存在4℃冰箱。如果室溫放置，RNase A活力會(huì)下降，導(dǎo)致RNA污染。
2、菌體過量。如果使用的菌體量過多，也可能導(dǎo)致RNA污染。適當(dāng)減少菌體的用量。
◆質(zhì)粒得率很低，請(qǐng)問是什么原因？
質(zhì)粒低的可能因素很多，以下是幾種可能原因：
1、菌體過量，導(dǎo)致菌體不能完全裂解和中和，最終導(dǎo)致質(zhì)粒得率低。
2、Buffer W2中未按瓶子上得標(biāo)注體積加入乙醇。
3、菌體老化，影響提取的效果。建議對(duì)菌液進(jìn)行劃板培養(yǎng)，篩選新鮮克隆。
◆請(qǐng)問Eluent Buffer的配方是什么？對(duì)于DNA測(cè)序有沒有影響？
Eluent Buffer 的配方是2.5mM Tris-HCl,pH8.0。質(zhì)粒在這樣的溶液中能夠穩(wěn)定保存，而且測(cè)序不受影響。
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